O DNA recombinante (RDNA ou rDNA) é uma molécula de ácido nucleico artificial criada em laboratório pela integração de segmentos de interesse de dois organismos. Também é conhecido como DNA quimérico, graças à sua propriedade híbrida. Este tipo de DNA não é encontrado na natureza.
A metodologia básica para gerá-lo inclui: (a) a seleção de um DNA alvo e sua inserção em outro fragmento de DNA (geralmente um plasmídeo bacteriano); (b) a introdução deste plasmídeo em uma bactéria, (c) a seleção da bactéria por meio de antibióticos e finalmente (d) a expressão do gene.
A técnica aproveita um conjunto de enzimas que permite copiar e colar fragmentos de DNA específicos a critério do pesquisador..
El objetivo de la tecnología recombinante es, en la mayoría de los casos, la expresión de una proteína (conocida como proteína recombinante) deseada por el biólogo molecular para futuras investigaciones o para crear una proteína de valor comercial y terapéutico - como la insulina humana, por exemplo.
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Todos os seres orgânicos que conhecemos compartilham várias características. Uma delas é a natureza do material genético e a forma como as proteínas são produzidas - um processo conhecido como o “dogma” central da biologia molecular..
Com exceção de alguns vírus, todos os organismos armazenam informações genéticas no DNA (ácido desoxirribonucléico), coletadas de forma muito compacta e organizada no núcleo da célula..
Para a expressão do gene, a molécula de DNA é transcrita em RNA mensageiro, e este é traduzido para a linguagem dos aminoácidos, os blocos de construção das proteínas..
Entre as décadas de 70 e 80, os biólogos moleculares passaram a aproveitar os processos que ocorrem naturalmente no interior da célula e conseguiram extrapolá-los para o laboratório..
Dessa forma, um gene de origem animal (um vertebrado, por exemplo) poderia ser inserido em um segmento de DNA de uma bactéria; ou o DNA de uma bactéria pode ser combinado com um DNA viral. Assim, podemos definir um DNA recombinante como uma molécula composta de DNA de dois organismos diferentes..
Uma vez que esta molécula híbrida ou recombinante foi criada, o gene de interesse é expresso. Com a palavra expressão queremos nos referir ao processo de tradução em proteína.
Um elemento chave no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante foi a descoberta de enzimas de restrição..
São moléculas de proteínas que apresentam a capacidade de clivar DNA (nucleases) em sequências específicas, servindo como “tesouras moleculares”. Os fragmentos gerados por essas enzimas são chamados de fragmentos de restrição.
As referidas enzimas podem produzir cortes simétricos na sequência alvo (em ambas as cadeias na mesma altura) ou cortes assimétricos. Um aspecto fundamental da ação das enzimas de restrição é que após a clivagem das cadeias, uma "borda solta" é obtida, complementar à outra borda cortada pela mesma enzima..
Alguns exemplos são ECOR 1 e Sma 1. Atualmente, mais de 200 tipos de enzimas de restrição são conhecidos e estão disponíveis comercialmente..
Para ser útil, uma tesoura deve vir acompanhada da cola. Esta ação de selamento do DNA (previamente tratado com enzimas de restrição) é realizada por ligases.
A seguir iremos descrever as principais etapas que a tecnologia de DNA recombinante requer. Todas são realizadas por profissionais de um laboratório de biologia molecular.
Antes de continuar com o protocolo experimental, devemos observar que em biologia molecular e biotecnologia o termo “clone” e o verbo “clone” são amplamente utilizados. Isso pode causar confusão.
Neste contexto, não estamos nos referindo à clonagem de tudo um organismo (como no caso da famosa ovelha Dolly, por exemplo), mas à clonagem de um fragmento de DNA, que pode ser um gene. Ou seja, produzir muitas cópias - geneticamente idênticas - da sequência.
A primeira etapa é decidir qual sequência você deseja usar. Isso depende totalmente do pesquisador e dos objetivos de seu trabalho. Este DNA deve então ser isolado e purificado. Os métodos e procedimentos para conseguir isso dependem, por sua vez, do corpo e do tecido.
Geralmente, um pedaço de tecido é retirado e submetido ao tratamento em um tampão de lise com proteinase K (uma enzima proteolítica) e, em seguida, o DNA é extraído. Posteriormente, o material genético é fragmentado em pequenos fragmentos.
Após as etapas preparatórias, o pesquisador busca introduzir o segmento de DNA de interesse em um vetor de clonagem. A partir de agora vamos chamar este segmento de DNA de DNA branco.
Um dos vetores mais usados em um plasmídeo de origem bacteriana. Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular de fita dupla encontrada naturalmente nas bactérias. Eles são estranhos ao cromossomo bacteriano - ou seja, são extracromossômicos e são encontrados naturalmente nesses procariotos.
Os elementos básicos de um vetor são: (a) uma origem de replicação, que permite a síntese de DNA; (b) agente de seleção, que permite identificar os organismos que carregam o plasmídeo com o DNA alvo, como resistência a algum antibiótico; e (c) local de multiclonagem, onde se encontram as sequências que serão reconhecidas pelas enzimas de restrição..
O primeiro DNA recombinante bem-sucedido em laboratório foi clonado no plasmídeo pSC101 da bactéria E. coli. Ele contém um sítio de restrição para a enzima de restrição EcoRI e um gene de resistência a antibióticos, além da origem de replicação..
A inserção do DNA alvo no plasmídeo é realizada usando as ferramentas moleculares de enzimas de restrição e ligases descritas na seção anterior..
Além dos plasmídeos, o DNA pode ser inserido em outro vetor, como o bacteriófago lambda, cosmídeos, YACs (cromossomos artificiais de levedura), BACs (cromossomos artificiais bacterianos) e fagemídeos..
Uma vez obtida a molécula de DNA recombinante (gene de interesse no plasmídeo ou outro vetor), ela é introduzida em um hospedeiro ou organismo hospedeiro, que pode ser uma bactéria..
Para introduzir DNA estranho em uma bactéria, é utilizada uma técnica chamada transformação bacteriana, onde o organismo é submetido a um tratamento com cátions divalentes que o torna suscetível à captação de DNA..
Metodologicamente, não podemos garantir que 100% das bactérias em nossa cultura tenham efetivamente absorvido nossa molécula de DNA recombinante. É aqui que entra em ação a porção do plasmídeo que contém resistência aos antibióticos..
Assim, a bactéria que absorveu o plasmídeo será resistente a um determinado antibiótico. Para selecioná-los, bastará aplicar o referido antibiótico e levar os sobreviventes.
Depois de selecionar a bactéria com nosso DNA recombinante, passamos a usar a maquinaria enzimática do hospedeiro para gerar o produto proteico de interesse. À medida que as bactérias se reproduzem, o plasmídeo é passado para seus descendentes, de modo que não é perdido durante a divisão..
Esse procedimento utiliza a bactéria como uma espécie de "fábrica" de proteínas. Mais tarde veremos que tem sido um procedimento muito relevante no desenvolvimento de tratamentos médicos eficazes..
Assim que a cultura estiver pronta e as bactérias produzirem grandes quantidades de proteína, a célula é lisada ou interrompida. Existe uma vasta gama de técnicas bioquímicas que permitem a purificação de proteínas de acordo com as suas características físico-químicas..
Em outro contexto experimental, podemos não estar interessados em gerar a proteína, mas sim em obter a sequência de DNA per se. Se fosse esse o caso, o plasmídeo seria usado para criar várias cópias do fragmento de interesse, a fim de ter o suficiente do DNA alvo para realizar os experimentos relevantes..
A tecnologia do DNA recombinante abriu um número infinito de possibilidades em biologia molecular, biotecnologia, medicina e outras áreas relacionadas. Suas aplicações mais destacadas são as seguintes.
A primeira aplicação está diretamente relacionada a laboratórios de biologia molecular. A tecnologia do DNA recombinante permite que os pesquisadores entendam a função normal dos genes, e as proteínas geradas podem ser usadas em pesquisas futuras..
As proteínas produzidas pelo procedimento de DNA recombinante têm aplicações na medicina. Dois exemplos muito relevantes na área são a insulina humana e o hormônio do crescimento, que é aplicado em pacientes que carecem dessa proteína..
Graças ao DNA recombinante, essas proteínas podem ser geradas sem a necessidade de extraí-las de outro ser humano, o que representa complicações metodológicas adicionais e riscos à saúde. Isso tem ajudado a melhorar a qualidade de vida de inúmeros pacientes..
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