O Ágar LIA (Ferro Lisina) é um teste bioquímico utilizado para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae. Este meio foi criado por Edwards e Fife, com base na fórmula de Falkow.
Originalmente, esse teste era um caldo contendo peptonas, extrato de levedura, glicose, L-lisina, roxo de bromocresol e água destilada. Edwards e Fife adicionaram ágar-ágar, citrato de amônio férrico e tiossulfato de sódio..
O teste consiste basicamente em demonstrar a presença da enzima lisina descarboxilase, capaz de reagir com o grupo carboxila do aminoácido L-lisina. A desaminação do aminoácido também pode ocorrer devido à presença da enzima lisina desaminase..
Além disso, a composição do meio permite evidências da capacidade de alguns gêneros bacterianos de produzir sulfeto de hidrogênio. Por fim, também é possível observar a geração ou não de gás no meio.
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Como a maioria dos meios de cultura, o ágar ferro lisina contém componentes que fornecem a fonte de nutrientes necessários para o crescimento bacteriano. Esses componentes são representados por peptonas e extrato de levedura.
Da mesma forma, este ágar contém glicose como um carboidrato fermentável. Todas as bactérias da família Enterobacteriaceae são conhecidas por fermentar glicose.
Essa etapa é fundamental, pois será responsável pela acidificação do meio, condição essencial para que a enzima lisina descarboxilase -se presente- atue sobre seu substrato..
Em alguns gêneros bacterianos, a produção de gás devido à fermentação da glicose pode ser observada.
O gás é evidenciado quando há deslocamento do ágar no tubo, deixando um espaço vazio no fundo do tubo, ou por fratura do meio em duas ou mais porções.
Uma vez que a lisina é descarboxilada, uma diamina (cadaverina) e dióxido de carbono são formados.
A descarboxilação ocorre na presença de coenzima de fosfato de piridoxal. Esta reação é irreversível.
Todas as mudanças de pH que ocorrem no meio devido às várias reações são detectadas pelo indicador de pH roxo do bromocresol..
Nesse sentido, quando há acidificação o meio fica amarelo, e quando há alcalinização o meio retorna à sua cor roxa ou roxa original..
Quando ocorre a desaminação da lisina devido à presença da enzima lisina desaminase, uma cor avermelhada é formada na superfície, típica dos gêneros Proteus, Providencia e algumas espécies de Morganella.
Isso se deve ao fato do ácido alfa-ceto-carbônico ser formado durante o processo de desaminação, que reage com o citrato de amônio na presença de oxigênio, causando a referida cor..
Por outro lado, as bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio serão evidenciadas pela presença de tiossulfato de sódio (fonte de enxofre) e citrato férrico de amônio, que é o criador do HdoisS.
As bactérias que possuem a enzima tiossulfato redutase têm a capacidade de atuar reduzindo o tiossulfato de sódio presente, formando sulfito e sulfeto de hidrogênio (HdoisS).
Este último é um gás incolor, mas quando reage com o sal de ferro forma sulfeto metálico ferroso, que é um composto insolúvel (precipitado preto visível).
No entanto, a capacidade de formação de HdoisS com este meio não é muito confiável, porque algumas bactérias lisina descarboxilase negativas capazes de produzir HdoisS não formará o precipitado preto, pois a acidez do meio interfere. Portanto, é recomendável verificar com outros meios de comunicação que contenham ferro.
Os tubos devem ser lidos após as 24 horas de incubação, caso contrário, existe o risco de interpretação errônea da reação, relatando falsos negativos.
Deve ser lembrado que a primeira reação que ocorrerá será a fermentação da glicose, pois todos os tubos após 10 a 12 horas ficarão amarelos..
Se ao final do tempo de incubação (24 horas) for observado um fundo amarelo com uma superfície roxa ou roxa, a reação é negativa. A cor púrpura da superfície corresponde à alcalinização do meio pelo uso de peptonas..
Uma reação positiva é aquela em que o fundo e a superfície do tubo ficam totalmente roxos, ou seja, ele retorna à cor original..
Portanto, quem determina a positividade do teste é a base ou background do meio. Em caso de dúvida sobre a cor, pode ser comparado a um tubo LIA não inoculado.
Um tubo que mostra a desaminação da lisina terá uma superfície marrom avermelhada e um fundo amarelo (ácido), ou todo o tubo terá uma cor marrom avermelhada..
Esta reação é interpretada como negativa para a descarboxilação da lisina, mas positiva para a desaminação da lisina..
Esta reação é definida e interpretada na moldura.
Uma reação positiva é observada pelo aparecimento de um precipitado preto em todo ou parte do meio. Normalmente entre a borda do chanfro e a base.
Se o precipitado ocorrer ao longo do tubo, ele não mostrará as outras reações que ocorrem no meio..
Ao interpretar o teste, os resultados são registrados da seguinte forma:
A moldura é lida primeiro, depois a parte inferior ou bloco e, em seguida, a produção de HdoisSim, e finalmente a produção de gás.
Exemplo: K / A + (-). Isso significa:
Pesar 35 g do meio de lisina ágar ferro desidratado e dissolver em um litro de água destilada..
Aquecer até que o ágar se dissolva completamente; para isso, deixe ferver por um minuto, mexendo sempre. Distribua 4 ml do meio em tubos de ensaio 13/100 com tampas de algodão.
Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Retire da autoclave e deixe descansar em ângulo, de modo que haja uma base profunda e um bisel curto.
Conservar no refrigerador 2-8 ° C. Deixe aquecer antes de semear a cepa bacteriana.
O meio desidratado é bege e o meio preparado é roxo avermelhado..
O pH final do meio preparado é 6,7 ± 0,2
O meio fica amarelo com pH igual ou inferior a 5,2 e é roxo em pH 6,5 e acima.
Este teste, junto com outros testes bioquímicos, é usado para identificar bacilos da família Enterobacteriaceae..
O meio é semeado com um laço reto ou agulha, um ou dois furos são feitos no fundo do tubo e, em seguida, a superfície do meio é marcada em zigue-zague..
Incubar por 24 horas a 35-37 ° C em aerobiose. Se necessário, incube por mais 24 horas..
É principalmente útil para diferenciar espécies de Citrobacter lactose negativas de Salmonellas sp.
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