O ágar sangue é um meio de cultura sólido enriquecido, diferencial mas não seletivo. É utilizado para a recuperação e crescimento de uma grande variedade de microrganismos de amostras clínicas ou para subculturas..
O ágar sangue clássico deve ser incluído para a semeadura da maioria das amostras clínicas recebidas no laboratório; exceto para amostras de fezes onde não é útil, a menos que preparado com certas modificações.
Este meio de cultura é constituído basicamente por ágar-base enriquecido e 5% de sangue. O ágar base pode variar de acordo com a necessidade, mas será composto principalmente por peptonas, aminoácidos, vitaminas, extrato de carne, cloreto de sódio, ágar, entre outros..
No que diz respeito ao sangue, normalmente é necessário o contato com um biotério para a obtenção de sangue de animais, como ovelhas, coelhos ou cavalos. No entanto, nem sempre isso é possível e às vezes é usado sangue humano..
O meio de ágar sangue pode ser preparado em laboratório ou pode ser adquirido já feito de empresas dedicadas. O preparo deste meio é um dos mais delicados, qualquer descuido em seu preparo resultará em um lote contaminado..
Por isso, todos os cuidados possíveis devem ser tomados e ao final um controle de qualidade deve ser realizado incubando a 37 ° C 1 placa para cada 100 preparadas.
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O ágar sangue é um meio enriquecido porque contém 5 a 10% de sangue em uma base de ágar como seu aditivo principal. Ambos os compostos contêm muitos nutrientes e esta propriedade permite que a maioria das bactérias cultiváveis cresça neles..
Esse crescimento ocorre sem restrição; por esse motivo, não é seletivo. Porém, se forem adicionados a esse meio compostos que impeçam o crescimento de alguns microrganismos e favoreçam o de outros, ele se torna seletivo. Este é o caso se certos tipos de antibióticos ou antifúngicos são adicionados.
Da mesma forma, o ágar sangue é um meio diferencial, pois permite distinguir 3 tipos de bactérias: beta-hemolítica, alfa-hemolítica e gama-hemolítica..
Os beta-hemolíticos são aqueles que têm a capacidade de lisar ou romper completamente os glóbulos vermelhos, formando um claro halo ao redor das colônias, por isso produzem ß ou ß-hemólise e os microrganismos são chamados de ß-hemolíticos..
Exemplos de bactérias ß-hemolíticas são Streptococcus pyogenes Y Streptococcus agalactiae.
Alfa-hemolíticos são aqueles que realizam hemólise parcial, onde a hemoglobina é oxidada a metemoglobina, gerando uma coloração esverdeada ao redor das colônias. Esse fenômeno é conhecido como α-hemólise ou α-hemólise e as bactérias são classificadas como α-hemolíticas..
Exemplos de bactérias α-hemolíticas são Streptococcus pneumoniae Y Estreptococo do grupo viridans.
Finalmente, existem as chamadas bactérias hemolíticas gama ou não hemolíticas. Estes crescem no ágar sem gerar alterações, um efeito conhecido como γ-hemólise, e os microrganismos são γ-hemolíticos..
Exemplo de bactéria γ-hemolítica: algumas cepas de Streptococcus do grupo D (Streptococcus bovis e Enterococcus faecalis).
O meio de cultura de ágar sangue é um dos mais comumente usados no laboratório de microbiologia..
Entre os microrganismos capazes de crescer no meio de ágar sangue estão: bactérias aeróbicas estritas, facultativas, microaerofílicas, anaeróbias, bactérias Gram positivas ou Gram negativas, bactérias de crescimento rápido ou crescimento lento.
Algumas bactérias nutricionalmente exigentes ou fastidiosas também crescem, assim como fungos e leveduras. Da mesma forma, é útil realizar subculturas ou reativar cepas que são metabolicamente muito fracas..
No entanto, a escolha do tipo sanguíneo e do ágar-base irá variar dependendo do provável microrganismo com suspeita de recuperação e do uso que será dado à placa (cultura ou antibiograma)..
O sangue pode ser cordeiro, coelho, cavalo ou humano.
O mais recomendado é o sangue de cordeiro, com algumas exceções. Por exemplo, para isolar espécies de Haemophilus, onde o sangue recomendado é sangue de cavalo ou coelho, uma vez que o sangue de cordeiro possui enzimas que inibem o fator V.
O menos recomendado é humano, porém é o mais utilizado, talvez por ser o mais fácil de obter..
O sangue deve ser desfibrinado, obtido sem qualquer tipo de aditivo e de animais saudáveis. Para o uso de sangue humano, vários fatores devem ser levados em consideração:
Se o sangue vier de indivíduos que tiveram infecções bacterianas, eles terão anticorpos específicos. Nessas condições, é provável que o crescimento de algumas bactérias seja inibido..
Se for obtido no banco de sangue, contém citrato e certas bactérias podem não crescer em sua presença. Por outro lado, se o sangue vier de pacientes que tomam antibióticos, o crescimento de bactérias suscetíveis pode ser inibido..
E se o sangue for de uma pessoa diabética, o excesso de glicose interfere no desenvolvimento adequado dos padrões de hemólise.
O ágar base usado para a preparação do ágar sangue pode ser muito amplo. Entre eles estão: ágar nutriente, ágar de infusão de cérebro e coração, ágar tripticase soja, ágar Müeller Hinton, ágar Thayer Martin, ágar Columbia, ágar Brucella, ágar Campylobacter, etc..
Essa base é a menos utilizada, pois irá cultivar principalmente bactérias não exigentes, como bacilos entéricos., Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, entre outros. Não é recomendado isolar Streptococcus.
É um dos mais utilizados como base de ágar sangue, pois possui os nutrientes necessários para o crescimento da maioria das bactérias, inclusive Streptococcus sp e outras bactérias fastidiosas. Embora não seja adequado para observar padrões de hemólise.
O sangue de cordeiro é geralmente usado com esta base.
Variantes de ágar sangue também podem ser preparadas, onde outros compostos são adicionados para isolar certos microrganismos. Por exemplo, ágar de infusão de cérebro e coração suplementado com sangue de coelho, cistina e glicose, serve para isolar Francisella tularensis.
Considerando que, com telurito de cistina é útil para o isolamento de Corynebacterium diphteriae. O sangue humano ou de cordeiro pode ser usado.
Com a primeira beta-hemólise será vista como um halo estreito, enquanto com a segunda o halo será muito mais amplo.
Da mesma forma, esta base juntamente com bacitracina, amido de milho, sangue de cavalo e outros suplementos de enriquecimento (IsoVitaleX), é usada para o isolamento do gênero Haemophilus sp de amostras respiratórias.
Além disso, se a combinação de antibióticos cloranfenicol - gentamicina ou penicilina - estreptomicina com sangue de cavalo for adicionada, é ideal para o isolamento de fungos patogênicos exigentes, mesmo com maior rendimento do que o ágar Sabouraud glicose. É especialmente útil para isolar Histoplasma capsulatum.
Essa base é a mais recomendada para melhor observação do padrão de hemólise e para a realização de exames diagnósticos como taxa de optoquina e bacitracina. É o ágar sangue clássico que é usado rotineiramente.
Com esta base, você também pode preparar o ágar sangue especial para Corynebacterium diphteriae, com telurito de cistina Y sangue de cordeiro.
Da mesma forma, a combinação deste ágar com sangue de cordeiro, mais canamicina-vancomicina é ideal para o crescimento de anaeróbios, especialmente Bacteroides sp.
Essa base suplementada com sangue é usada para realizar o antibiograma de microrganismos exigentes, como Streptococcus sp.
Também é útil para o isolamento de bactérias, como Legionella pneumophila.
Este meio é ideal como base para ágar sangue quando houver suspeita do gênero Neisseria, especialmente Neisseria meningitidis, já que N. gonorrhoeae não cresce em ágar sangue.
Também é usado para realizar testes de suscetibilidade a Neisseria meningitidis.
Esta base é excelente para semear amostras de biópsia gástrica para Helicobacter pylori.
O meio é preparado adicionando 7% de sangue de cordeiro desfibrinado com antibióticos (vancomicina, trimetoprima, anfotericina B e cefsulodina) para restringir o crescimento de outros tipos de bactérias que possam estar presentes..
Esta mesma base suplementada com sangue humano ou de cordeiro, ácido nalidíxico e colistina é útil para isolar Gardnerella vaginalis. Também é ideal para avaliar a susceptibilidade antimicrobiana a antibióticos do mesmo microrganismo.
Além disso, é utilizado para a preparação de ágar sangue para cultivo de anaeróbios, com adição de aminoglicosídeos e vancomicina..
Esta base permite que você observe adequadamente os padrões de hemólise.
Este meio usado como base para ágar sangue juntamente com a adição de vitamina K é ideal para o cultivo de bactérias anaeróbias. Nesse caso, recomenda-se o uso de sangue de cordeiro..
Ágar Campylobacter suplementado com 5% de sangue de ovelha e 5 antibióticos (cefalotina, anfotericina B, trimetoprima, polimixina B e vancomicina), é o meio usado para isolar Campylobacter jejuni em amostras de fezes.
Cada casa comercial traz no verso do recipiente as instruções para o preparo de um litro de meio de cultura. Os cálculos correspondentes podem ser feitos para preparar a quantidade desejada, dependendo do ágar base selecionado.
O ágar base é desidratado (pó), portanto deve ser dissolvido em água destilada ajustada para pH 7,3.
A quantidade indicada pelo ágar base escolhido é pesada e dissolvida na quantidade correspondente de água em um frasco, a seguir aquecida em fogo moderado e misturada com movimentos rotativos até que todo o pó esteja dissolvido..
Uma vez dissolvido, esterilizar em autoclave a 121 ° C por 20 minutos.
Ao sair da autoclave, o frasco é deixado resfriar até que a temperatura oscile entre 40 a 50 ° C; É uma temperatura que a pele humana suporta e ao mesmo tempo o ágar ainda não se solidificou..
Para isso, o frasco é tocado com a mão e se o calor for tolerável, é a temperatura ideal para adicionar a quantidade correspondente de sangue desfibrinado (50 ml para cada litro de ágar). Misture suavemente para homogeneizar.
A passagem da agregação sanguínea é fundamental, pois se for feita com o meio muito quente os glóbulos vermelhos se rompem e o meio não servirá para observar hemólise.
Se adicionado muito frio, formar-se-ão grumos e a superfície da mídia não ficará lisa para permitir a marcação adequada..
Sirva em placas de Petri estéreis imediatamente após homogeneizar o sangue. Aproximadamente 20 ml são despejados em cada placa de Petri. Este procedimento é realizado em uma capela de fluxo laminar ou próximo ao queimador.
Ao servir o ágar sangue nas placas de Petri, nenhuma bolha de ar deve permanecer na superfície da placa. Se isso acontecer, a chama do bico de Bunsen é passada rapidamente sobre o prato para eliminá-los..
As placas solidificam e são armazenadas no refrigerador (2-8 ° C) invertidas até o uso. Antes de usar as placas de ágar sangue, elas devem ser temperadas (até atingir a temperatura ambiente) para poderem ser semeadas..
Os pratos preparados duram aproximadamente 1 semana.
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