O Biuret é um reagente utilizado para a determinação de proteínas de cadeia longa e de cadeia curta. É especialmente usado na área de química analítica e urinálise para investigar a concentração de proteínas totais no soro, plasma e urina..
Os valores das proteínas podem ser aumentados ou diminuídos em certas patologias. Os sintomas de hipoproteinemia geralmente ocorrem em pacientes com doença renal, em pacientes desnutridos e em pacientes com infecções crônicas..
Já a hiperproteinemia é observada em patologias como mieloma múltiplo, lúpus eritematoso sistêmico, endocardite bacteriana, meningite bacteriana, macroglobulinemia de Waldenstrom, entre outras..
Por outro lado, a presença de proteínas na urina se deve à filtração da albumina pelo rim. Este é um comportamento patológico que deve ser estudado.
Nesse sentido, o Biureto é muito útil, pois permite quantificar a presença de proteínas no soro, plasma, urina, entre muitas outras amostras..
Mesmo o Biureto pode ser usado para investigar a presença e concentração de proteínas em amostras pouco exploradas ou amostras de composição desconhecida. Portanto, é amplamente utilizado na área de pesquisa..
O teste de Biureto é baseado na detecção de ligações peptídicas. O teste é realizado em meio alcalino. A amostra deve conter pelo menos duas ligações peptídicas para a formação de um complexo violeta-púrpura. O complexo é formado pela união das ligações e do íon cobre.
Índice do artigo
O reagente do Biuret é composto de hidróxido de potássio, sulfato cúprico e tartarato de sódio e potássio. O hidróxido de sódio é utilizado para alcalinizar o meio, uma vez que essa condição é essencial para que a reação ocorra..
A substância que reage com as proteínas é o sulfato cúprico, enquanto o tartarato de sódio tem a função de não permitir a formação do hidróxido de cobre, que tende a precipitar e interferir na reação..
Se substâncias com ligações peptídicas (polipeptídeos ou proteínas) forem encontradas na amostra, o teste será positivo.
Uma reação é interpretada como positiva quando a solução fica roxa. A cor é produzida pela formação de um complexo entre pelo menos duas ligações peptídicas que possuem o grupo CO-NH e os cáprios cúpricos.
O complexo violeta pode ser formado de duas maneiras: uma é pela perda de prótons dos grupos amida que se ligam ao metal (despronotação), e a outra pela união dos elétrons de oxigênio e nitrogênio que são livres e se ligam ao cobre..
Esta reação pode variar em intensidade e cor dependendo do tipo de proteína..
O teste pode ser realizado qualitativa ou quantitativamente. Na forma qualitativa, é relatado como positivo ou negativo. Enquanto na forma quantitativa a concentração pode ser medida pelo método espectrofotométrico.
A reação é lida entre 540-560 nm. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de ligações peptídicas na amostra..
-Hidróxido de sódio (NaOH) 20%
-1% de sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4. 5hdoisOU)
-Tetra-hidrato de tartarato de potássio de sódio misto (KNaC4H4OU64hdoisOU)
-Deve ser mantido refrigerado.
-Coloque 100 µl da amostra ou padrão a ser analisado em um tubo de ensaio.
-Adicione 2 ml de hidróxido de sódio.
-Misture muito bem.
-Adicione 5 ml de reagente Biureto.
-Misture e deixe repousar 25 minutos em temperatura ambiente, cubra e proteja da luz.
-Observar a formação ou não da cor e medir espectrofotometricamente.
A albumina sérica bovina pode ser usada como padrão para realizar a curva de calibração. Várias concentrações são preparadas a partir dele. Por exemplo 25, 50, 75, 100, 125 e 150%.
A reação é montada com todas essas concentrações conhecidas e a absorbância é lida em um comprimento de onda de 540 nm. Com os dados das concentrações conhecidas e as leituras de absorbância é feita a curva de calibração.
Em cada determinação ou lote de amostras processadas, é recomendável montar um padrão. Albumina de soro bovino 0,1-2 mg / ml pode ser usada como padrão de calibração..
As medições são feitas em um espectrofotômetro a 540 nm.
A linearidade é atendida até uma concentração de 12 g / dl.
Embora não seja muito frequente, deve-se ressaltar que algumas substâncias podem interferir durante a execução deste teste. Por exemplo, a presença de amônia pode inibir a formação de coloração.
Da mesma forma, outras substâncias podem absorver no mesmo comprimento de onda, como certos pigmentos..
Por outro lado, a interferência pode ser gerada quando uma substância diferente da ligação peptídica forma um complexo com o sal cúprico. Exemplo: alguns carboidratos e certos lipídios.
Se a amostra a ser analisada apresentar algum tipo de precipitado, ela deve ser filtrada ou centrifugada antes da montagem do teste..
O teste não é afetado pela presença de:
-Bilirrubina até uma concentração de 20 mg / dl.
-Hemoglobina até uma concentração de 750 mg / dl.
-Dextran até uma concentração de 30 g / L.
-Triglicerídeos até uma concentração de 4000 mg / dl.
-É um método simples de executar.
-É um teste econômico.
-Possui alta especificidade para proteínas.
-Pouca interferência.
Tem pouca sensibilidade para detectar baixas quantidades de proteína. O trabalho realizado por Fuentes e colaboradores afirma que o método de teste do Biureto tem limite de detecção de 1 mg / ml de proteína e limite de quantificação de 3 mg / ml.
No entanto, outras pesquisas realizadas na Universidade da Amazônia relatam valores muito mais baixos. O limite de detecção informado pelo estudo é de 0,020 mg / ml e o limite de quantificação é de 1,33 mg / ml..
O reagente ou teste de Biureto é usado para a determinação de proteínas em amostras clínicas e não clínicas em laboratórios de pesquisa e de rotina.
Em muitas patologias é importante determinar a concentração de proteínas totais em amostras clínicas, que pode ser alta ou baixa.
Eles são elevados em:
-Mieloma múltiplo,
-Lúpus eritematoso sistêmico,
-Endocardite bacteriana,
-Meningite bacteriana,
Macroglobulinemia de Waldenstrom, entre outros.
É diminuído em:
-Insuficiência renal,
-Pessoas com graus severos de desnutrição,
-Pacientes com infecções crônicas, entre outros.
As amostras clínicas mais comuns são soro, plasma e urina. O valor normal das proteínas no soro ou plasma é 6,0-8,8 gr / dl.
A concentração de proteína na urina em adultos não excede a cifra de 150 mg / 24 horas.
Bebês: < a 0,50 mg
Crianças a partir de 2 anos: índice: 0,20 mg
Adultos: < 0,2 mg
A reação do Biureto pode ser usada para muitos tipos de amostras não clínicas, como laticínios, antiveneno ou qualquer substância desconhecida para a qual você deseja investigar a presença de proteínas..
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