O DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) É um corante que, por sua propriedade fluorescente, serve como marcador, sendo amplamente utilizado na técnica de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo, entre outras. A fluorescência que ele emite é azul brilhante, sua excitação ocorre entre 455-461 nm (luz UV).
O corante DAPI pode passar pela membrana celular de células mortas com grande facilidade. Também pode manchar os núcleos das células vivas, mas, neste caso, a concentração deste deve ser maior.
O corante é capaz de acessar o DNA celular pelo qual possui afinidade especial, ligando-se com grande avidez às bases nitrogenadas adenina e timina. Por este motivo, é muito útil em algumas técnicas de biologia molecular..
Este composto pertence ao grupo dos corantes indol e demonstrou ter maior sensibilidade ao DNA do que o brometo de etídio e o iodeto de propídio, especialmente em géis de agarose..
O uso desse corante fluorescente é muito amplo, pois é útil para: estudar mudanças no DNA em processos apoptóticos (morte celular) e, portanto, detectar células neste processo; para pegada de foto de DNA (impressão de foto de DNA); estudar contaminação bacteriana; ou para visualizar a segmentação nuclear.
Também tem sido utilizado no estudo de bandas cromossômicas, na detecção de DNA de Mycoplasmas sp, na interação DNA-proteína, na coloração e contagem de células por imunofluorescência e até mesmo para colorir grãos de pólen maduros.
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DAPI é a abreviação de seu nome químico (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Sua fórmula molecular é C16HquinzeN5. Ele tem um peso molecular de 350,3. Perto da faixa de luz ultravioleta (345 a 358 nm) ocorre a excitação máxima do complexo DAPI-DNA, enquanto a emissão máxima de fluorescência ocorre entre 455-461 nm..
Este corante é caracterizado por ser um pó amarelo, mas as estruturas marcadas com este fluoróforo emitem uma luz azul brilhante..
É um composto solúvel em água, porém, para acelerar sua dissolução, um pouco de calor pode ser aplicado. Pode ser diluído com PBS, mas não diretamente dissolvido nele..
Uma vez preparado o corante, ele deve ser armazenado no escuro, ou seja, protegido da luz, a uma temperatura de 2 a 8 ° C (refrigerador). Nessas condições, o corante é estável por mais de 3 semanas ou meses..
Se for protegido da luz, mas deixado em temperatura ambiente, sua estabilidade cai para 2 ou 3 semanas, mas exposto à luz direta a deterioração é muito rápida. Se você quiser armazenar por muito mais tempo, pode ser refrigerado a -20 ° C distribuído em alíquotas.
Esta coloração baseia-se na geração de uma contracoloração nuclear nas principais técnicas de biologia molecular, tais como: citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e coloração de cromossomos metafásicos ou núcleos interfásicos, entre outras..
Essa técnica se baseia na grande afinidade que o corante tem pelas bases nitrogenadas (adenina e timina) contidas no material genético (DNA) do sulco menor. Enquanto no nível citoplasmático, deixa muito pouco fundo.
Quando o corante fluorescente se liga às regiões de adenina e timina do DNA, a fluorescência aumenta significativamente (20 vezes mais). A cor que emite é azul brilhante. Notavelmente, não há emissão de fluorescência quando se liga aos pares de bases GC (guanina-citosina).
É importante observar que embora também tenha afinidade pelo RNA, isso não causa problemas, pois o maior grau de emissão de energia dessa molécula ocorre em outro comprimento de onda (500 nm), ao contrário do DNA, que o faz a 460 nm. . Além disso, o aumento da fluorescência uma vez anexado ao RNA é de apenas 20%..
DAPI é usado mais para corar células mortas (fixas) do que células vivas, uma vez que uma concentração muito maior do corante é necessária para corar o último, isso porque a membrana celular é muito menos permeável a DAPI quando está viva.
A coloração DAPI pode ser usada em combinação com fluoróforos vermelhos e verdes para uma experiência multicolorida.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) é um excelente fluoróforo e é, portanto, amplamente utilizado em várias técnicas e para vários fins. O uso de DAPI nas principais técnicas é explicado a seguir.
Os pesquisadores Gohde, Schumann e Zante em 1978 foram os primeiros a usar e propor o DAPI como fluoróforo na técnica de citometria de fluxo, tendo grande sucesso devido a sua alta sensibilidade ao DNA e sua alta intensidade na emissão de fluorescência..
O uso de DAPI nesta técnica permite o estudo do ciclo celular, a quantificação de células e a coloração de células vivas e mortas..
Embora existam outros corantes, como brometo de etídio, óxido de Hoechst, laranja de acridina e iodeto de propídio, o DAPI é um dos mais utilizados por ser mais fotoestável do que os citados anteriormente..
Para essa técnica é necessário fixar as células, para isso pode-se usar etanol absoluto ou paraformaldeído 4%. A amostra é centrifugada e o sobrenadante descartado, posteriormente as células são hidratadas pela adição de 5 ml de tampão PBS por 15 minutos..
Enquanto o tempo passa, prepare a coloração DAPI com um tampão de coloração (FOXP3 da BioLegend) a uma concentração de 3 µM.
Centrifugue a amostra, descarte o sobrenadante e cubra com 1 ml de solução DAPI por 15 minutos em temperatura ambiente..
Leve a amostra ao citômetro de fluxo com o laser apropriado.
Outra técnica em que o DAPI é usado é em microfluorometria de fluxo junto com outro fluoróforo chamado mitramicina. Ambos são úteis para quantificar DNA de cloroplasto individualmente, mas DAPI é mais adequado para medir partículas de bacteriófago T4..
Esta técnica usa basicamente sondas de DNA marcadas com um corante fluorescente que pode ser DAPI..
A amostra requer tratamento térmico para desnaturar o DNA de fita dupla e convertê-lo em duas fitas simples. Posteriormente, é hibridizado com uma sonda de DNA desnaturada marcada com DAPI que possui uma sequência de interesse..
Depois é lavado para eliminar o que não hibridizou, um contraste é usado para visualizar o DNA. O microscópio de fluorescência permite a observação da sonda hibridizada.
Esta técnica tem por objetivo detectar sequências específicas no DNA cromossômico, podendo fazer o diagnóstico de certas doenças..
Essas técnicas cito-moleculares têm sido de grande ajuda na determinação de detalhes no estudo dos cariótipos. Por exemplo, ele mostrou as regiões ricas em pares de bases de adenosina e timina chamadas regiões heterocromáticas ou bandas DAPI..
Essa técnica é amplamente utilizada para o estudo de cromossomos e cromatina em plantas e animais, bem como no diagnóstico de patologias pré-natais e hematológicas em humanos..
Nesta técnica, a concentração recomendada de DAPI é 150 ng / ml por um período de 15 minutos..
As lâminas montadas devem ser armazenadas protegidas da luz a 2-8 ° C.
As células são fixadas com paraformaldeído a 4%. Se outras manchas forem usadas, DAPI é deixado no final como uma contracoloração e as células são cobertas com solução de PBS por 15 minutos. Enquanto o tempo passa, prepare a solução DAPI diluindo com PBS, de modo que a concentração final seja 300 µM.
Em seguida, o excesso de PBS é removido e coberto com DAPI por 5 minutos. É lavado várias vezes. A lâmina é observada em um microscópio de fluorescência sob o filtro apropriado.
Este composto deve ser manuseado com cuidado, pois é um composto que possui propriedades mutagênicas. O carvão ativado é usado para eliminar esse composto das soluções aquosas que serão descartadas..
Luvas, avental e óculos de segurança devem ser usados para evitar acidentes com este reagente. Se ocorrer contato com a pele ou mucosa, a área deve ser lavada com bastante água.
Você nunca deve pipetar este reagente com a boca, use pipetas.
Não contamine o reagente com agentes microbianos, pois isso levará a resultados errôneos.
Não dilua a coloração DAPI mais do que o recomendado, pois isso diminuirá significativamente a qualidade da coloração..
Não exponha o reagente à luz direta ou mantenha-o aquecido, pois isso reduz a fluorescência.
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