O teste de catalase é uma metodologia utilizada em laboratórios de bacteriologia para revelar a presença da enzima catalase nas bactérias que a possuem. Juntamente com a coloração de Gram, são os principais testes que devem ser realizados em microrganismos recém-isolados. Esses testes orientam o microbiologista sobre os passos a seguir para a identificação definitiva do microrganismo em questão..
Em geral, as bactérias que contêm citocromo possuem a enzima catalase, o que significa que as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas devem possuí-la. Porém, há exceções, como o Streptococcus, que apesar de serem microorganismos anaeróbios facultativos não possuem a enzima catalase.
É por isso que o teste da catalase é usado principalmente para distinguir as famílias Staphylococaceae e Micrococaceae (ambas catalase positiva) da família Streptococaceae (catalase negativa)..
Da mesma forma, o gênero Bacillus (catalase positiva) é diferenciado do gênero Clostridium (catalase negativa), entre outros.
Índice do artigo
A catalase é uma enzima classificada como hidroperoxidase, ou seja, utiliza peróxido de hidrogênio (HdoisOUdois).
Também é considerada uma oxidorredutase, pois na reação em que participa há um elemento que atua como doador de elétrons (substância redutora) e outro como receptor de elétrons (substância oxidante)..
A catalase é uma proteína que contém um grupo prosérico com quatro átomos de ferro trivalente (Fe+++), portanto, é uma homoproteína. O íon férrico permanece oxidado durante a reação.
Pode-se dizer que a catalase é uma enzima desintoxicante, pois sua função é eliminar substâncias que são produzidas durante o metabolismo bacteriano e que são tóxicas para as bactérias. Entre essas substâncias está o peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio é formado a partir da quebra de açúcares aerobicamente. Este processo ocorre da seguinte forma:
O íon superóxido (Odois-) (radical livre) é formado como o produto final da assimilação da glicose pela via aeróbia. Este é tóxico e é eliminado pela enzima superóxido dismutase que o transforma em oxigênio gasoso e peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio também é tóxico para as bactérias e deve ser removido. A enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.
A catalase pode atuar em outros substratos além do peróxido de hidrogênio, como álcoois, aldeídos, ácidos, aminas aromáticas e fenóis. No entanto, o peróxido de hidrogênio também pode ser usado pela catalase para oxidar outros compostos tóxicos, como o álcool metílico e etílico..
Da mesma forma, a catalase está presente nas células fagocíticas, protegendo-as da ação tóxica do peróxido de hidrogênio..
3% de peróxido de hidrogênio (10 volumes).
Lâmina de microscópio
Cabo de plástico descartável ou palito de madeira.
Pegue uma quantidade suficiente da colônia para estudar sem tocar no ágar de onde veio. A colônia deve ser fresca, ou seja, de uma cultura de 18 a 24 horas.
Coloque a colônia na lâmina seca e sobre ela adicione uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% (você também pode usar HdoisOUdois 30%). Observe imediatamente se as bolhas são liberadas ou não.
Reação positiva: evolução de gás, evidenciada pela formação de bolhas (borbulhamento forte).
Reação negativa: sem formação de bolhas.
Coloque 1 ml de HdoisOUdois 3% em uma placa pura ou cultura em cunha que não contém sangue (de preferência ágar nutriente). Observe se há ou não formação de bolhas imediatamente. Você também pode usar HdoisOUdois 30%.
É interpretado da mesma forma que o método porta object.
Preencher um tubo capilar de 67 mm até uma altura de 20 mm com peróxido de hidrogênio a 3% por capilaridade.
Toque a colônia isolada a ser estudada com o capilar cheio de HdoisOUdois às 3%. Observe se o capilar se enche de bolhas em aproximadamente 10 segundos. Este método permite a semiquantificação da reação em cruzamentos:
Sem cruzes, sem bolhas (reação negativa).
+ --Poucas bolhas (reação fraca ou retardada).
++ -Bolhas abundantes (reação moderada).
+++ -As bolhas atingem o extremo oposto (reação energética).
Em uma lâmina limpa e seca, coloque uma colônia isolada e, em seguida, coloque uma gota de HdoisOUdois 0,5% e cubra com uma lamela. Observe se há ou não formação de bolhas presas.
Interpretação: a presença de bolhas indica uma reação positiva. Sem bolhas, é interpretado como uma reação negativa.
Essa técnica precisa ser feita controlando o pH e a temperatura. Deve ser executado sob uma capela de fluxo laminar, uma vez que a manipulação das diferentes espécies de Mycobacterium é perigosa.
Peróxido de hidrogênio 30% ou 110 volumes (superoxal).
Tampão de fosfato pH 7
10% Tween 80
Cultura de Mycobacterium wedge por 3 a 4 semanas
Pesar:
1,361 g (KHdoisPO4) fosfato monopotássico anidro.
1,420 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO3).
Dissolva ambos os sais em um pouco de água destilada estéril e complete a 1000 ml com água.
Faça uma diluição de 1:10 no Tween 80 que está comercialmente concentrado, para fazer isso da seguinte forma:
Pegar 1 ml de Tween 80 e colocar em um pouco de água destilada, dissolver e completar o volume com água até 10 ml.
Misture uma quantidade de tampão de fosfato com uma quantidade de Tween 80 a 10% (em partes iguais). Defina no laboratório o quanto você deseja preparar.
Coloque 5 ml de tampão de fosfato em um tubo de teste estéril com tampa de rosca (baquelite).
Com um loop de inoculação, pegue colônia suficiente de um crescimento de Mycobacterium semeado em fatias e dissolva no tampão de fosfato.
Tampe o tubo sem apertar demais a rosca. Coloque em banho-maria a 68 ° C por 20 a 30 minutos. Remova e resfrie a 22-25 ° C
Meça 0,5 ml do reagente final (mistura) e adicione ao tubo com a solução fria. Observar a formação ou não de bolhas.
É interpretado da mesma forma que as técnicas anteriores.
Quando o crescimento da colônia é obtido em meio enriquecido, uma coloração de Gram e um teste de catalase devem ser realizados nas colônias obtidas. Isso orientará o microbiologista sobre os procedimentos a serem seguidos para a identificação definitiva..
Para avaliar o bom desempenho do reagente de peróxido de hidrogênio, use cepas de controle recém-cultivadas, como Staphylococcus aureus como um controle positivo e cepas de Streptococcus sp como controle negativo.
Outra alternativa que serve como controle positivo é colocar uma gota de peróxido de hidrogênio no ágar sangue, os eritrócitos possuem catalase, portanto, haverá borbulhamento se o reagente estiver em bom estado..
Um ágar chocolate pode ser usado como controle negativo, aqui os eritrócitos já estão lisados e o teste é negativo.
-Não use culturas antigas para o teste, pois isso pode levar a falsos negativos.
-Evite colher colônias de culturas de ágar sangue, tomando cuidado para não tocar no ágar; este procedimento pode levar a falsos positivos, pois os eritrócitos contêm catalase.
-Se você usar a colônia de loção de platina, não inverta a ordem do procedimento, pois isso pode levar a falsos positivos. Isso ocorre porque a platina é capaz de reagir com o peróxido de hidrogênio, causando um borbulhamento..
-Não use o reagente de peróxido de hidrogênio se for muito antigo, pois o reagente é muito instável e tende a quebrar com o tempo..
-Armazene o reagente de peróxido de hidrogênio protegido da luz e refrigerado para evitar danos..
-Realize uma verificação de qualidade no reagente de peróxido de hidrogênio cada vez que for usado.
-Leve em consideração que se o HdoisOUdois a 30% as reações são mais fortes do que aquelas realizadas com HdoisOUdois às 3%.
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