O Mancha Kinyoun é uma técnica de coloração usada para colorir bactérias e parasitas álcool-ácido resistentes. Nasceu da modificação da coloração Ziehl-Neelsen; Ambas as técnicas são interpretadas da mesma forma, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e em que a técnica de Kinyoun não usa calor.
Por esta razão, também é conhecida como mancha fria de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modificada a frio. É indicado para a coloração de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, micobactérias atípicas, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris Y Cyclosporas cayetanensis.
É importante ressaltar que os Nocardia tingem fracamente com esta técnica por serem parcialmente resistentes ao álcool-ácido, portanto para este gênero há uma modificação da metodologia..
Por sua vez, a técnica fria Kinyoun foi combinada com a técnica tricrômica modificada por Didier para a detecção de coccídios (Cryptosporidium parvum e Isospora belli) e esporos de microsporídios (Enterocytozoon bieneusi Y Encephalitozoon intestinalis).
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O principal reagente de coloração é a carbolfucsina ou carbol fucsina, que tem a propriedade de se ligar aos ácidos carbólicos existentes na parede celular cerosa, ricos em lipídios (ácidos micólicos) de micobactérias e certos parasitas..
Essa ligação não é neutralizada pelo alvejante ácido; portanto, os microrganismos são definidos como resistentes ao álcool-ácido.
Ao contrário da técnica de Ziehl-Neelsen -que fixa o corante pelo calor-, na técnica de Kinyoun esta etapa não é necessária, pois a solução de carbol-fucsina preparada para esta técnica contém uma alta concentração de fenol..
O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, permitindo a entrada do corante carbolfuchsin. Depois que o corante penetra, ele permanece fixo, apesar da lavagem com o álcool ácido.
Dessa forma, os microrganismos resistentes ao ácido assumem a cor vermelha característica, enquanto tudo o que não é álcool resistente ao ácido fica descolorido e manchado de azul..
- Fucsina carbol modificada.
- Álcool-ácido.
- Azul de metileno.
- Fucsina básica: 4 gr.
- Fenol: 8 ml.
- Álcool (95%): 20 ml.
- Água destilada: 100 ml.
A fucsina básica deve ser dissolvida lentamente no álcool, misturando constantemente. Posteriormente, o fenol cristalizado é derretido em banho-maria a 56 ° C. Uma vez dissolvido, 8 ml são adicionados à solução de fucsina preparada acima.
- Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.
- Etanol (95%): 97 ml.
Deve ser medido, unido e misturado.
- Azul de metileno: 0,3 g.
- Água destilada: 100 ml.
É pesado e dissolvido.
1- Prepare um esfregaço diretamente da amostra, que pode ser escarro, líquido pulmonar, sedimento urinário, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros; ou de uma suspensão de microrganismos obtidos de colônias puras desenvolvidas em meios de cultura primários.
2- Fixe o esfregaço com calor.
3- Coloque o esfregaço na ponte de coloração e cubra com o reagente Kinyoun carbol fucsina preparado. Deixe descansar por 3 ou 5 minutos.
4- Lave com água destilada.
5- Lixívia com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.
6- Lixívia novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos até que não haja mais coloração.
7- Lave com água destilada e deixe escorrer, colocando a lâmina na posição vertical.
8- Cubra o preparo com azul de metileno e deixe agir por 4 minutos.
9- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.
10- Examine a 40X e depois a 100X.
Se você quiser melhorar e acelerar a coloração de microrganismos álcool-ácido resistentes, adicione 1 gota de um agente umectante (como o Tergitol nº 7) a 30 ou 40 ml de Kinyoun Carbol Fuchsin.
Alguns laboratórios mudam o corante de contraste azul de metileno para verde brilhante ou ácido pícrico; o primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.
Para melhorar a coloração de bactérias do gênero Nocardia, uma modificação da coloração Kinyoun é usada. A técnica é a seguinte:
1- Cubra o esfregaço com Kinyoun carbol fucsina por 3 minutos.
2- Lave com água destilada.
3- Descolorir brevemente com álcool ácido preparado a 3% até que não haja mais coloração.
4- Lave novamente com água destilada.
5- Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 30 segundos.
6- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.
Esta técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes para coccídios e esporos de Microsporidium sp ao mesmo tempo. O procedimento a seguir é o seguinte:
1- Cubra o esfregaço com Kinyoun carbol fucsina por 10 minutos.
2- Retire o corante e lave com água destilada.
3- Lixívia por 30 segundos com álcool de ácido clorídrico.
4- Lave novamente com água destilada.
5- Cubra o esfregaço com solução de tricromo por 30 minutos a 37 ° C.
6- Lave com água destilada.
7- Lixívia por 10 segundos com álcool ácido acético.
8- Lave o esfregaço por 30 segundos usando etanol 95%.
Como controle positivo, os esfregaços são preparados com cepas de Mycobacterium tuberculosis e corar com os reagentes preparados para verificar se as bactérias adquirem a cor adequada (vermelho-fúcsia).
Os controles negativos também podem ser usados para preparar esfregaços com qualquer cepa que não seja ácido-resistente, verificando se toda a amostra fica com a cor contrastante..
A técnica Kinyoun é mais simples, pois elimina a etapa de aquecimento, mas sua principal vantagem é evitar a emissão de vapores, altamente tóxicos e cancerígenos em longo prazo. Portanto, a coloração Kinyoun é mais segura para o pessoal de coloração..
É importante levar em consideração que deve-se ter cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o alvejante é inflamável..
Quanto às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o organismo não está presente. Além disso, a presença de detritos celulares pode levar a falsos positivos, levando a confusão no diagnóstico..
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